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Dossier : Rayonnement synchrotron - de Frascati à Soleil (1963-2013)

Apports historiques du rayonnement synchrotron

Chapitre III - La biocristallographie avec le rayonnement synchrotron : débuts au Lure et évolution
Biocristallography with synchrotron radiation: a start in LURE and further evolutions
Roger Fourme
p. 56-59

Résumés

L’étude structurale par cristallographie aux rayons X des macromolécules biologiques a été révolutionnée par l’utilisation du rayonnement synchrotron (RS). Cet outil améliore considérablement la qualité de données, en termes de signal/bruit et de résolution en un temps d’exposition très court. Dès les débuts de DCI (1976) une ligne fut dédiée à la biocristallographie et améliorée pour cette utilisation notamment en termes de détection et d’analyse des données. Le Lure, laboratoire ouvert à toutes les nouveautés fut pionnier dans le développement de la biocristallographie avec le RS et fut à l’origine d’un DEA national en France, créant ainsi une communauté de jeunes chercheurs de haut niveau solidaires.

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Texte intégral

1Le rayonnement synchrotron (RS) a révolutionné la principale méthode expérimentale de la biologie structurale, la biocristallographie avec les rayons X, qui permet la détermination de la structure tridimensionnelle des macromolécules biologiques à résolution quasi-atomique. Il s’agit d’une méthode d’imagerie indirecte, dans laquelle on enregistre la diffusion coopérative (diffraction) des rayons X par les myriades de molécules identiques contenues dans un petit cristal. Il y a deux étapes essentielles. La première consiste à recueillir, sur un détecteur bidimensionnel, les impacts (taches de Bragg) des faisceaux diffractés lors de la rotation du cristal éclairé par un faisceau monochromatique quasi parallèle de rayons X. La seconde consiste à calculer la densité électronique de la molécule en effectuant une synthèse de Fourier dont les termes sont l’amplitude et la phase de chaque faisceau diffracté. Contrairement à l’amplitude, la phase n’est pas directement accessible par la mesure : récupérer l’information manquante ne peut être obtenu par les méthodes statistiques dites "directes" (non applicables aux molécules à grand nombre d’atomes) mais par des procédés expérimentaux utilisant des mesures de diffraction effectuées dans des conditions particulières. La troisième étape consiste à interpréter la densité initiale pour obtenir un modèle moléculaire, dont les paramètres obtenus après « affinement » (coordonnées atomiques, facteurs d’agitation thermique) seront déposés dans une banque de données, la PDB (Protein Data Bank).

  • 1 kDa pour kiloDalton. Le Dalton est le nom donné à l’unité de masse atomique en biologie, en l’honne (...)

2La biocristallographie est la principale application du RS, qu’il s’agisse du nombre de lignes de lumière utilisées à cette fin (actuellement plus de 130 selon le consortium Biosync) ou de publications (avec ou sans pondération par le facteur d’impact). Rien moins que 7119 structures résolues avec le RS ont été déposées dans la PDB en 2011. Le RS est utilisé pour l’enregistrement des données de diffraction. Il améliore la qualité de ces données en termes de signal/bruit et de résolution, avec des temps d’exposition très courts. Le haut débit de dose permet d’extraire plus d’informations par cristal et d’utiliser des microcristaux. De plus, comme la longueur d’onde du faisceau X est ajustable à volonté, la diffusion anomale des rayons X à une ou plusieurs longueurs d’onde (méthodes SAD et MAD pour, respectivement, Single wavelength et Multiple wavelength Anomalous Diffraction) par une espèce minoritaire dans le cristal est utilisée pour l’estimation des phases. Le phasage à l’aide de diffuseurs anomaux intrinsèques (atomes de soufre de certains acides aminés) ou extrinsèques (sélénium, terres rares, métaux lourds) est aujourd’hui pratiqué à très grande échelle et a supplanté la méthode historique de phasage par les atomes lourds. À l’heure actuelle, la totalité des données de diffraction nécessaire à la « résolution » de la structure tridimensionnelle d’une protéine de poids moléculaire moyen (30 kDa)1 peut être enregistrée en quelques dizaines de secondes et un premier modèle moléculaire obtenu en quelques minutes, dans les cas favorables. Ces progrès prodigieux résultent de l’amélioration du matériel (RS, monochromateur, détecteur pixellisé) et des outils logiciels.

  • 2 La chambre de rotation d’Arndt-Wonnacott est un dispositif qui permet de réaliser plusieurs exposit (...)

3Le Lure fut l’un des laboratoires pionniers de ce champ de recherche dès le début de l’exploitation du RS de l’anneau DCI opérant en mode parasite (1976). La première ligne de lumière D1 desservait six dispositifs expérimentaux, dont l’un (D12) était dédié à la biocristallographie. Ce montage était équipé d’une chambre à rotation de Arndt-Wonnacott à détection photographique2 et d’un monochromateur doté d’une lame de germanium taillée en forme de triangle allongé. La courbure cylindrique ajustable était obtenue simplement en déplaçant l’extrémité de la lame avec une vis micrométrique, un principe largement repris par la suite (Lemonnier et al., 1978). Les premiers clichés de diffraction furent enregistrés par R. Kahn, J. Janin et R. Fourme en octobre 1976. Le montage D12 fut le premier utilisé en routine pour la biocristallographie avec le RS dont il contribua à populariser l’utilisation dans une communauté qui, initialement, était souvent réticente à quitter le laboratoire. Parmi les premiers résultats les plus notables émergent 1) la deoxy hémoglobine à haute résolution (1.74 Å) (Fermi et al., 1985) et 2) les débuts de la virologie avec le RS. Ainsi, grâce à un système de collimation conçu par Paul Sigler à Chicago, de bons clichés de diffraction furent obtenus, en collaboration avec Jack Johnson à San Diego, avec des cristaux de virus à grande maille cristalline (paramètres de 300 à 1000 Å) (Usha et al., 1984). Le montage D12 fut surtout utilisé par des visiteurs étrangers, pour des raisons indiquées plus loin.

4Le développement de la biocristallographie avec le RS dépendait impérativement de la disponibilité de détecteurs plus performants que les films. N. H. Xuong à San Diego, en collaboration avec V. Perez-Mendes à Berkeley, avait réalisé, sur la base des travaux de G. Charpak, un détecteur électronique de type chambre proportionnelle multifils (MWPC pour multiwire proportional chamber) adapté à la radiocristallographie (Cork et al., 1974). Ce détecteur avait la précision intrinsèque d’un compteur de photons et un bruit propre quasi nul, mais souffrait d’un phénomène de parallaxe entraînant une élongation des taches de diffraction croissant avec l’inclinaison du faisceau diffracté par rapport à la normale à la surface du détecteur. Au cours d’une réunion qui s’est tenue en 1973, G. Charpak, R. Mössbauer, F. Parak et R. Fourme décidèrent de construire deux chambres à fils, l’une pour la spectroscopie Mössbauer et l’autre pour le RS. Ces détecteurs comportaient un espace de dérive, délimité par un bord conique et deux électrodes sphériques transparentes, dans lequel les lignes de champ étaient radiales, ce qui supprimait la parallaxe (Kahn et al., 1982). Il s’ensuivit une collaboration de longue durée entre l’équipe du Lure (R. Kahn, R. Fourme puis R. Bosshard) et celle de G. Charpak au CERN. Trois détecteurs différents furent ainsi construits (Mark I, II et III). Le détecteur Mark II avait une surface sensible en forme de disque de diamètre 486 mm partitionnée en 185 500 pixels de 1x1 mm2 (Kahn et al., 1986a). L’encodeur digital de position permettait un taux de comptage de 0,3 MHz. G. Bricogne, qui avait rejoint l’équipe du Lure, fut à l’origine, en 1986, d’une initiative coopérative européenne d’où résulta une suite de logiciels (EEC MADNES) permettant l’analyse des images enregistrées avec diverses configurations de diffractomètres et de détecteurs (Bricogne, 1987). Les détecteurs Mark II et III furent installés avec ces logiciels respectivement sur les lignes D2 et D4 du Lure-DCI. Ils ont fourni des données de très haute qualité, mais leur complexité et leur fragilité ainsi que la lourde astreinte requise de l’équipe locale ont conduit à les remplacer, en 1993, par des détecteurs à plaque photo-imageante (imaging plates) simples et rustiques.

  • 3 La parvalbumine est une protéine intracellulaire (cytosolique) qui fixe le calcium. Abondante dans (...)
  • 4 Ho ou Holmium, est une terre rare de la série des Lanthanides comme le Terbium,
  • 5 RXR pour Retinoid X Receptor : c’est un facteur protéique qui agit dans le noyau des cellules comme (...)

5Le groupe du Lure a effectué de nombreux travaux sur les méthodes de détermination des phases par voie expérimentale. Un premier résultat notable fut la détermination de la structure d’une parvalbumine3 extraite de la vessie natatoire du poisson Opanus Tau (Kahn et al., 1985, 1986b). O. Dideberg à Liège substitua des ions de terre rare Tb3+ aux deux ions Ca2+ de la protéine native. Les données furent enregistrées avec le détecteur Mark I et phasées en utilisant la diffusion anomale du terbium au voisinage du seuil d’absorption LIII. La portée de ce travail fut relativement limitée parce que la faible puissance du calculateur et le logiciel rudimentaire utilisé sur le détecteur Mark I limitaient la précision des données, et aussi parce que la structure de la parvalbumine de carpe, de repliement similaire, était déjà connue. Il s’agissait pourtant de la première détermination de la structure d’une nouvelle protéine utilisant la méthode MAD. La même méthodologie fut appliquée quelques années plus tard à une autre protéine de repliement inconnu en utilisant des ions Ho3+4(Weis et al., 1991). Ce travail, publié dans la revue Science, constitue une autre étape importante dans le développement de la méthode MAD en raison de la haute qualité du phasage issu des données enregistrées avec le détecteur MARK II et analysées avec EEC MADNES. Une variante (dénommée MASC) de la méthode MAD fut également explorée en théorie et en pratique (Fourme et al., 1995). Dans cette méthode, on utilise la diffusion anomale d’ions dispersés dans la phase liquide du cristal pour déterminer l’enveloppe de la protéine. Il s’avère que la dispersion uniforme des ions dans la solution est difficile à réaliser car, en général, les diffuseurs se fixent en des sites particuliers de la protéine. Cette observation fut le point de départ de travaux récents de R. Kahn et E. Girard à l’Institut de Biologie structurale de Grenoble portant sur le phasage à l’aide des complexes de terres rares dispersés dans la solution. L’équipe du Lure, sous l’impulsion de T. Prangé, a été également à l’origine d’un renouveau de l’utilisation des atomes de gaz rares (xénon, krypton) pour la solution du problème des phases (Schiltz et al., 1995). Ces atomes se fixent réversiblement dans des poches hydrophobes sous une pression de quelques bars, créant des dérivés parfaitement isomorphes et qui diffusent anomalement. La première structure qui fut résolue par cette méthode est un domaine du récepteur nucléaire humain RXR5 (Bourguet et al., 1995), de l’Institut de génétique, de biologie moléculaire et cellulaire à Strasbourg, une publication citée plus de mille fois. Cette méthode est maintenant utilisée en routine et des appareillages commerciaux pour la mettre en œuvre sont disponibles. Il faut mentionner enfin les recherches de G. Bricogne, dont une partie importante a été effectuée durant son séjour au Lure. Ces travaux portent sur l’affinement sans biais des structures partielles d’atomes mous et de diffuseurs anomaux dans le phasage de novo (c’est à dire sans information préalable sur le modèle moléculaire) des structures macromoléculaires. Un formalisme permettant le traitement rigoureux des signaux faibles issus des structures partielles a été élaboré et implémenté dans le programme SHARP (de La Fortelle et Bricogne, 1997). Ceci a permis un saut qualitatif de la qualité des cartes de densité électronique phasées de novo. Le programme SHARP a été très largement diffusé ; il est actuellement utilisé par des centaines d’équipes dans le monde.

6Des méthodes permettant d’analyser quantitativement la perfection des cristaux de protéines (en vue notamment de caractériser les effets de la croissance en apesanteur), ont été mises au point avec B. Capelle et A. Ducruix, combinant analyse de profil de diffraction avec une onde plane de rayons X (ligne de lumière D25 sur DCI), topographie et résolution du diagramme de diffraction (Fourme et al. 1995). Enfin, la cristallographie des macromolécules sous haute pression a été développée au Lure à l’initiative de I. Ascone et R. Fourme, en collaboration avec M. Mézouar à l’ESRF (Fourme et al., 2001). Les données sont enregistrées avec du rayonnement X de très courte longueur d’onde à l’ESRF et plus récemment à Soleil. Les équipes françaises sont encore leader dans ce domaine.

7Le Lure a donc été un laboratoire pionnier dans le développement de la biocristallographie avec le RS. Dans la première décennie (1976-1986 environ), on notera que la communauté française n’était pas en mesure de tirer pleinement parti du RS et des développements induits. Elle était en construction, avec un retard considérable sur les équipes anglaises, américaines et allemandes puisque la première structure de protéine d’un laboratoire français fut publiée dix-sept ans après le prix Nobel (1962) des pères fondateurs Max Perutz et John Kendrew. Ceci fut un handicap pour le Lure, en particulier pour la mise en pratique de la méthode MAD. La situation s’est normalisée quelques années plus tard, suite à un effort national coordonné par le CNRS (et, dans une moindre mesure, par le CEA) qui se traduira par une utilisation assidue des quatre lignes de biocristallographie finalement installées au Lure (W32, W21, D23, D41). Le Lure fut aussi le berceau du DEA de cristallographie et RMN biologiques, un DEA national associant les universités de Paris-Sud, Louis Pasteur et Joseph Fourier. Cette formation fut un outil majeur dans la création d’une communauté solidaire de jeunes chercheurs de haut niveau.

8Le Lure fut un laboratoire très ouvert et vibrant, immergé dans le campus d’Orsay avec ses étudiants et son riche contexte syndical, politique et associatif, accueillant des chercheurs passionnés et d’origines très diverses (grands organismes, universités, visiteurs, thésards et chercheurs embauchés sur contrats post-doctoraux). La structure du laboratoire était propice aux échanges et aux contacts pluridisciplinaires. Cet acquis et l’appui de la communauté scientifique furent décisifs pour préparer et réussir l’aventure de Soleil. Bref, ce fut un privilège de travailler dans un lieu et à une époque où les chercheurs disposaient - plus qu’aujourd’hui - du temps, de la liberté de choix et de la disponibilité nécessaires à la réflexion et à la prise de risque requises par la recherche fondamentale.

9Je remercie mes collègues du Lure qui ont contribué aux développements en biocristallographie et notamment R. Kahn, G. Bricogne, W. Shepard, A. Lewit-Bentley, I. Ascone, T. Prangé, M. Schiltz, I. Li de la Sierra et M. Roth. D’autres techniques biophysiques, non abordées dans cet article, ont également été développées dans la section « biologie » du Lure, avec plusieurs lignes de lumière sur les anneaux DCI et Super Aco : la diffusion aux petits angles (P. Vachette, J. Perez, D. Durand, A. Tardieu), la spectroscopie d’absorption X (I. Ascone), la diffraction par des échantillons imparfaitement cristallisés (J. Doucet, J.P. Benoit) et la fluorescence résolue en temps (J.C. Brochon, J. Gallay, M.Vincent, F. Mérola, I. Moya).

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Bibliographie

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Bricogne, G., (1987). Computational aspects of protein crystal analysis, J.R. Helliwell, 1987, p 120-145.

Cork, C., Hamlin, R., Vernon, W., Xuong N.H. & Perez-Mendes, V., J. Appl. Cryst. 7, 1974, p. 319-323.

Fermi, G., Perutz, M., Shanaan, B. & Fourme, R., J. Mol. Biol. 175, 1985, p. 159-174.

Fortelle E., de la & Bricogne, G., Methods Enzymol., 286, 1997, p. 159-174.

Fourme, R., Shepard, W., Kahn, R., L’Hermite G., de La Sierra I.L., J. Synchrotron Rad. 2, (1995), p. 36-48.

Fourme, R., Ducruix, A., Ries-Kautt, M. & Capelle, B., J. Synchrotron Rad. 2, 1995, p. 136-142.

Fourme, R., Kahn, R., Girard, E., Horentrup, C., Prangé, T & Ascone, I., J. Synchrotron Rad. 8, 2001, p. 1149-1156.

Kahn, R., Fourme, R., Bosshard, R., Caudron, B., Santiard, J.C. & Charpak, G. (1982). Nucl. Instrum. Methods, 201, 203-208

Kahn, R., Fourme, R., Bosshard, R., Chiadmi, M., Risler, J.L., Dideberg, Wery, O., Febs Lett. 179(1), 1985, p. 133-137.

Kahn, R., Fourme, R., Bosshard, R. & Saintagne, Nucl. Instrum. Methods, A246, 1986a, p. 596-603.

Kahn, R., Fourme, R., Bosshard, R., Chiadmi, M., Risler, J.L., Brunie, S., Wery, J.P., Dideberg, O. & Janin, J., in, Structural biological applications of X-ray absorption, scattering and diffraction, H.D. Bartunik & B. Chance (eds), New York, Academic Press. (1986), p 297-304.

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Schiltz, M., Prangé, T. & Fourme, R., J. Appl. Cryst. 27, 1994, p. 950-960.

Usha, R., Johnson, J.E., Moras, D., Thierry, J.C., Fourme, R. & Kahn, R., J. Appl. Cryst. 17, 1984, p. 147-153.

Weis, W.I., Kahn, R., Fourme, R., Drickamer, K. & Hendrickson, W.A., Science, 254, 1991, p. 1608-1615.

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Notes

1 kDa pour kiloDalton. Le Dalton est le nom donné à l’unité de masse atomique en biologie, en l’honneur de John Dalton. C’est 1/16e de la masse d’un atome d’oxygène, c'est-à-dire une valeur proche de la masse d’un atome d’hydrogène (1,00794 unité de masse atomique, uma)

2 La chambre de rotation d’Arndt-Wonnacott est un dispositif qui permet de réaliser plusieurs expositions concurrentes dans une même direction. Il est utilisé, afin d’augmenter la résolution des spots de diffraction, dans l’étude par rayons X de cristaux à large maille qui nécessite une grande distance (de l’ordre de 6o mm) entre le cristal et la plaque d’enregistrement positionnée perpendiculairement au faisceau de rayons X.

3 La parvalbumine est une protéine intracellulaire (cytosolique) qui fixe le calcium. Abondante dans certains types de neurones et dans le tissu musculaire squelettique et cardiaque, elle joue un rôle de régulateur du calcium libre intracellulaire

4 Ho ou Holmium, est une terre rare de la série des Lanthanides comme le Terbium,

5 RXR pour Retinoid X Receptor : c’est un facteur protéique qui agit dans le noyau des cellules comme un médiateur de la réponse cellulaire à la présence d’acide rétinoïque en activant des régions spécifiques du génome nucléaire. Ce facteur régulateur de la transcription du génome joue notamment un rôle important dans le développement embryonnaire.

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Pour citer cet article

Référence papier

Roger Fourme, « Apports historiques du rayonnement synchrotron », Histoire de la recherche contemporaine, Tome III - N°1 | -1, 56-59.

Référence électronique

Roger Fourme, « Apports historiques du rayonnement synchrotron », Histoire de la recherche contemporaine [En ligne], Tome III - N°1 | 2014, mis en ligne le 15 juin 2016, consulté le 19 octobre 2017. URL : http://hrc.revues.org/557

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Auteur

Roger Fourme

Synchrotron-Soleil

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Droits d’auteur

© Comité pour l’histoire du CNRS

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